你知道：细胞被支原体污染后，你是无法在显微镜下用肉眼判断吗?

你知道：全球体外细胞培养支原体的污染率高达30-60%吗？

你知道：支原体污染具有隐蔽性，显微镜下肉眼无法判断吗？

你知道：支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数吗？从而导致实验结果不准确，甚至完全错误吗？有人估计全球每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费高达数十亿美元！

鉴于支原体污染的巨大危害，从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求所有涉细胞培养的实验都要进行支原体检测。

你想知道：你的细胞被支原体污染了吗？

哺乳动物细胞的培养，支原体污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

支原体通过产生代谢产物及消耗各种养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而改变细胞的代谢状态。支原体可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体可以利用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列改变，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及补偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度，导致细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随后，细胞的生长特性发生改变，使某些酶和细胞因子的产生增加，并表现出一些特殊的细胞功能，而其它一些细胞正常的功能则被抑制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分。随着细胞膜成分的改变，细胞的形态及抗原性发生改变。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验结果导致研究误入歧途。此外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到抑制并丧失产生单抗的能力。

培养法是最可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。有的实验室使用荧光染色法检测支原体，但是该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。目前，细胞培养液中支原体污染的检测通常使用的是PCR法。

可以说，到目前为止，针对体外细胞培养的支原体检测的方法还没有一种单独使用就可以保证100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。

（1）支原体固体培养法。通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落，而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。这就意味支原体固体培养法漏检率高达20-50%。

（2）PCR法。PCR法导致的假阳性大家比较熟悉，无需多说。值得注意的是，由于细胞培养液中，经常会含有强烈抑制PCR扩增的代谢产物，如果不进行样品的前处理而直接使用细胞培养原液进行PCR检测，产生假阴性的概率是非常大的。

（3）荧光染色法。由于该方法本身的灵敏度较低，轻度的支原体污染往往无法检测出来。该方法漏检率也不会低。

（4）各种宣称检测支原体特异性酶的方法，我们对此持谨慎态度。比如Lonza公司的依据支原体特异性酶而设计的支原体检测试剂盒，其说明书就明确写明：其结果会受到哺乳动物细胞本身的干扰，其检测过程必须离心去除哺乳动物细胞。这就是悖论：该支原体检测试剂盒不是宣称根据支原体特异性酶而设计的吗？怎么会被哺乳动物细胞本身干扰呢？如果会被哺乳动物细胞本身干扰，那岂不说明哺乳动物细胞本身也含有该酶？如此，假阳性岂能避免？由于类似的支原体检测试剂盒说明书都没有公布具体的支原体特异性酶的名称，其是否会被哺乳动物或普通的细菌、真菌干扰而产生假阳性，我们对此持高度谨慎态度。希望进行细胞支原体污染检测的具体人员自己好好研究鉴别一下。再者，其灵敏度如何也需要比较后才知道。

综上所述，要想获得100%正确的支原体检测结果，必须至少使用2种，最好使用3种不同原理的方法同时进行检测，这样才能保证检测结果接近100%正确。

国内免疫细胞的肿瘤治疗进行的如火如荼，培养细胞之余通过如此复杂的支原体检测方法，仍不能确定细胞是否被支原体污染，你是否对检测支原体感到精疲力尽？？？细胞培养中支原体的来源大部分是通过培养基原料中的蛋白质引入的，如人血源来源的人血清白蛋白（HSA），人血来源的转铁蛋白（Transferrin）等。目前行业内推行的无动物成分（animal-component free）无血清培养基便很好的解决了这一问题。无动物成分（animal-component free）无血清培养基中所有原料均通过基因重组技术表达，并GMP条件下生产。

禾元生物作为无血清培养基领域的领导者和倡导者，其植物源系列产品

---

OsrHSA-重组人血清白蛋白(Recombinant Human serum albumin)，

OsrbFGF-重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human basic fibroblast growth factor)，

OsrTF-重组转铁蛋白(Recombinant transferring)，

OsrIGF-1-重组类胰岛素生长因子(Recombinant insulin-like growth factor-1)

---

凭借纯植物提取、不含任何动物来源成分、生物活性高、表达量高、稳定性好等特点被成熟地运用到细胞治疗领域，为国内外细胞治疗项目所遇到的困难与障碍，提供绿色、创新的可持续解决方案。
 

附：生物学研究中支原体污染的参考文献

1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！

由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to anadditional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appearedup to 15 fold resistant to doxorubicin.）

参考文献：

Falsification oftetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasmacontamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.

2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。

（1）The capacity ofthese cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma.Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature asthey do in response to most viruses and bacteria.

（2）Furtherinvestigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions weredue to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication ofmycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, puremycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce thesame effects.

参考文献：

（1）Dendritic cellmaturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur.J. Immunol. 2000. 30: 705–708.

（2）Mycoplasma-mediatedalterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. JBiomed Sci. 2005;12(1):31-46.

3.神经生物学：支原体污染本身可以直接降解淀粉样多肽Amyloid-beta (Abeta)！

These data showthat mycoplasmas degrade Abeta and thus may represent a significant source ofvariability when comparing extracellular Abeta levels in different cell lines.

参考文献：

（1）Amyloid-betapeptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. BMC Res Notes.2008 Jun 30;1:38.

（2）Neuroprotectiveeffects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Yhuman neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in themycoplasma-infected cells. Neurochem Int. 2011Mar;58(4):497-503.

4.生物化学：支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢！

Thisdemonstrates that infection with M. hyorhinis leads to different effects ongene regulation of the murine and human iNOS gene. Our study underlines theimportance of routine checking of cell cultures for mycoplasma contamination,particularly in studies on NO-mediated effects or inflammatory processes.

参考文献:

Impact of Mycoplasma hyorhinis infection onL-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOSgene. Biol Chem. 2005 Oct;386(10):1055-63.

5.病理学：支原体污染可以直接刺激前列腺素E2（Prostaglandin E2）的产生！

Mycoplasmafermentans (MF) also stimulated PGE(2) production. The co-infection ofmycoplasma and Chlamydia resulted in an additive effect in the production ofPGE(2). Thus it is important to use host cells and Chlamydia free of mycoplasmacontamination for the analysis of Chlamydia-induced prostaglandin production.

参考文献:

Production ofprostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis,Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans. Microb Pathog. 2004Sep;37(3):155-61.

6. 基因的表达与调控：支原体污染可以显著改变数百个基因的表达水平！

支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个（Even so, more than 200 genes were identifiedas being up- or down-regulated, demonstrating that mycoplasma infection has aprofound effect on gene expression patterns.）。有些基因的表达甚至相差十几倍！（A variety ofpathways are af­fected, and both up-regulation (up to 10-fold) anddown-regulation (up to 12-fold) were seen.）

参考文献:

Miller CJ,Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infectionsignificantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.